海洋浮游生物作为海洋生态系统物质循环和能量流动的重要环节, 在海洋生态系统元素循环过程中起着关键作用。磷作为海洋浮游生物生长所必需的生源要素, 是海洋浮游生物乃至整个海洋生态系统的物质基础, 是海洋生物体有机物元素构成的重要组分之一, 并且磷的含量及其与碳、氮等营养元素的组成比例与重要的生态功能密切关联, 不仅会影响整个海洋食物网, 还是海洋生物地球化学循环变化的重要驱动因素之一[1-6]。因此, 建立一种能准确、快速测定海洋浮游生物中总磷含量的方法显得尤为重要, 亦对更加深入了解营养元素循环过程具有重要意义。

目前, 样品中总磷含量的测定方法主要包括分光光度法、流动注射(FIA)、离子色谱(IC)和电感耦合等离子体发射光谱法(inductively coupled plasma- optical emission spectroscopy, ICP-OES) [7-10]。其中, 分光光度法是我国多个行业现行的总磷检测标准方法, 且多以磷酸盐为测定主体, 但该方法测定步骤繁琐, 需进行色度-浊度补偿, 试剂需求种类多, 方法中所用还原剂对苯二酚是剧毒物质, 对实验人员和环境均有极大的危害, 线性范围也比较窄。流动注射法虽可实现自动在线消解, 但所需试剂种类亦较多, 且试剂消耗量也比较多、容易引起二次污染。离子色谱法检出限高, 不能满足磷含量低的样品的检出要求。ICP-OES作为一种在发射光谱法基础上发展起来的一种新技术, 与上述检测方法相比, 具有测定快速、线性范围宽、灵敏度高、检出限低、稳定性好、干扰小及多元素同时测定等优点, 已成为准确测定金属元素和部分非金属元素的重要检测工具[11-13]。

文献中对于海洋浮游生物样品中总磷的测定方法报道不多[14-15]。在运用ICP-OES检测海洋浮游生物中总磷的技术中, 由于其生存的高盐特殊环境, 体内除含有碳、氮、磷等主要元素外, 还含有大量钾、钙、钠、镁等共存元素, 这些共存元素会对磷的准确测定产生基体抑制效应, 抑制损失发射光谱的信号强度。另外, 磷的四条发射谱线(P213.617 nm、P214.914 nm、P178.221 nm和P177.434 nm)发射强度都相对较低, 基体效应的存在会导致光谱图基线漂移。上述问题的存在都会导致检测结果的不准确。为解决这些问题, 本文结合样品特异性, 在微波密闭消解预处理样品的基础上, 对ICP-OES分析谱线、射频功率、雾化气流速、观测高度、蠕动泵泵速和观测方式等方法参数进行优化, 同时联合标准加入法建工作曲线, 增强发射光谱强度, 降低基体抑制效应和基线漂移对测定结果的影响, 消除样品差异性, 构建确定了准确测定海洋浮游生物中总磷的优化条件和技术流程。对方法的加标回收率、精密度、检出限等进行了实验确定, 实现了海洋浮游生物中总磷的准确测定, 同时也为其他海洋生物以及高基体样品中磷元素的准确测定提供科学的实验依据。

Optima 7300 DV电感耦合等离子体原子发射光谱仪(美国PerkinElmer公司); Ethos UP微波消解仪(意大利Milestone公司); DHG-9053A型热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司); BT125D电子天平(德国Sartorius公司); 移液枪(100~1 000 μL、0.5~5 mL, 德国Eppendorf公司); Milli-Q Direct 8超纯水仪(美国Millipore公司)。

HNO3 (UPS级高纯, 上海傲班科技有限公司); H2O2 (优级纯, 国药集团化学试剂有限公司); 磷单元素标准溶液(1 000 μg/mL, 国家有色金属及电子材料分析测试中心); 用于配制标准溶液与样品溶液的超纯水(电阻率18.2 MΩ·cm)。实验中所有器皿均用20% HNO3浸泡24 h后, 用超纯水冲洗3次, 晾干备用。

本实验中使用的实验样品包括5种浮游植物:小球藻(Chlorella vulgaris)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、中肋骨条藻(Skeletonema costatum)、斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)、新月菱形藻(Nitzsehia closteztuma); 5种浮游动物:中华哲水蚤(Calanus sinicus)、褶皱臂尾轮虫(Brachionus plicatilis)、蒙古裸腹水溞(Moina mongolica Daday)、凶型箭虫(Sagitta ferox), 肥胖箭虫(Sagitta enflata)。生物样品先用自来水仔细冲洗3遍, 再用超纯水冲洗3遍, 最后置烘箱中100℃烘干, 供微波消解备用。

样品前处理方法采用微波密闭消解法[16]。具体方法为:准确称取0.1000 g左右样品(干样)于消解罐中, 加入5.0 mL浓HNO3、1.0 mL浓H2O2, 加盖预消解过夜。次日, 将盛有样品的消解罐置于微波消解仪中, 按设置好的消解程序消解(表 1)。完全消解后, 待消解罐内温度低于40℃时取出, 置于赶酸仪上赶酸, 至溶液近干时, 加1 mL HNO3溶液, 微热浸提, 最后将消解液全部转移至50.0 mL容量瓶中, 用去离子水洗涤消解罐3~4次, 合并洗涤液, 并以去离子水定容至刻度线, 摇匀上机备用。同法做试剂空白实验。

Optima 7300 DV电感耦合等离子体原子发射光谱仪具体工作条件如下:磷检测波长P213.617 nm, 射频功率1 300 W, 雾化器压力97 MPa, 等离子体气流量15.0 L/min, 辅助气流量0.2 L/min, 雾化气流量0.8 L/min, 观测高度14 mm, 溶液提升量1.5 mL/min, 积分时间20 s, 延迟时间20 s, 观测方式轴向, 重复测定次数3次。

标准加入法是一种有效校正基体干扰的分析方法。当难以配制与样品溶液相似的标准溶液, 或样品基体成分很高且变化不定时, 采用标准加入法能够消除样品差异性, 有效解决高盐基体干扰, 提高分析方法的准确性。

标准加入法是分取数份体积相同的待测试样, 其中一份待测试样中不加标准溶液, 其余各份待测试样中分别加入不同已知量的被测元素标准溶液, 按照绘制标准曲线的步骤依次进行测量。以加入的被测元素标准液浓度为横坐标, 对应的光谱强度为纵坐标, 绘制标准曲线, 用外推法(延长标准曲线和横坐标相交的数值绝对值)可得待测样品溶液浓度。

本实验标准溶液的配制:

取1.0 mL溶度为1 000 μg/mL的磷标准溶液于100 mL容量瓶中, 用Milli-Q去离子水定容至刻度, 摇匀, 即得浓度为10.0 mg/L的磷标准溶液。

在5个10 mL容量瓶中分别加入9.0 mL已消解好的样品溶液(见1.3.1), 然后分别加入0.0、0.2、0.4、0.6 mL浓度为10.0 mg/L的磷标准溶液, 用样品溶液定容至刻度, 摇匀, 得到浓度分别为0.0、0.2、0.4、0.6 mg/L的磷系列标准溶液。按照优化好的仪器工作条件, 选取P213.617 nm分析谱线, 用ICP-OES依次对磷系列标准溶液进行测定, 以磷标准溶液的浓度0.0、0.2、0.4、0.6 mg/L为横坐标, 对应的发射光谱强度为纵坐标作图, 得到磷元素标准加入法标准曲线, 曲线回归方程为A = 1 463C + 297.3, 相关系数r = 0.999 348, 曲线线性关系良好(图 1)。将曲线反向延长与横坐标轴相交, 其交点即为样品溶液中磷的浓度, 该浓度为0.203 mg/L, 乘以定容体积50 mL, 除以样品质量0.113 4 g, 即得本实验中海洋浮游生物样品中磷的浓度为89.51 mg/kg。在此方法基础上, 可依次进行其他样品的测定, 得到不同海洋浮游生物中磷含量。

分析谱线和仪器工作条件的选择优化是ICP- OES光谱分析中的两个最重要的环节, 两者会影响样品分析结果的准确度。本文针对目标元素的分析特点, 结合样品的特异性, 对ICP-OES分析谱线、射频功率、雾化气流速、观测高度、蠕动泵泵速和观测方式进行优化选择, 以获得准确测定海洋浮游生物样品中磷的最佳技术方法。

分析谱线的选择应遵循谱线发射强度高、干扰少、稳定性好, 灵敏度高、检出限低以及背景等效浓度低等原则。由ICP-OES仪器软件WinLab32推荐的磷分析谱线有4条, 分别是: P213.617 nm、P214.914 nm、P177.434 nm和P178.221 nm。由于P177.434 nm和P178.221 nm两条谱线处于真空紫外区, 在不使用氮气吹扫或氩气吹扫的常规检测模式下, 氧气会对P177.434 nm和P178.221 nm谱线吸收, 导致两条谱线均无信号响应。即使仪器光路室通入氮气或高纯氩气进行长时间吹扫(低流量2 mL/min吹扫通常需要8h以上, 高流量5 mL/min吹扫至少需要2 h以上), 由于这两条谱线发射强度极低, 1.0 mg/L的磷标准溶液谱线的发射净强度仅有59.9 (P177.434 nm)和101.2 (P178.221 nm) (图 2), 在耗时耗气的情况下所得的检测结果并不理想, 不仅增加了分析时间和实验成本, 而且背景等效浓度高, 精密度和检出限都较差, 故不适合作为分析谱线。P214.914 nm谱线发射强度也很低, 1.0 mg/L的磷标准溶液谱线的发射净强度仅有322.9 (图 3), 同时受到干扰谱线的重叠干扰, 故亦不适合作为分析谱线。P213.617 nm谱线的发射强度比P214.914 nm, P177.434 nm和P178.221 nm的发射强度都高, 1.0 mg/L的磷标准溶液P213.617 nm谱线的发射净强度为2148.4 (图 3), 分别是三者发射强度的6.65倍、35.9倍、21.2倍, 并且不受其他谱线的干扰, 光强稳定性好, 背景等效浓度低, 灵敏度高, 线性相关系数好。因此, P213.617 nm是比较理想的分析谱线。

保持分析谱线P213.617 nm, 雾化气流量0.8 L/min, 观测高度14 mm, 进样泵速1.5 mL/min, 观测方式轴向等条件不变, 调节射频功率为1 000、1 100、1 200、1 300、1 400和1 500 W时, 测定1.0 mg/L的磷标准溶液, 光谱发射强度及信噪比随功率变化如图 4所示。

由图 4可以看出, 1.0 mg/L的磷标准溶液光谱发射强度随着射频功率的增加而增强, 可知, 高功率可以获得更大的光谱发射强度。但是, 射频功率过大也会导致背景光谱强度增加, 从而使信噪比降低, 检出限增大; 射频功率过低则会影响原子的蒸发、解离和谱线的发射强度。综合考虑, 本文选择射频功率为1 300 W。

保持分析谱线P213.617 nm, 射频功率1 300 W, 观测高度14 mm, 进样泵速1.5 mL/min, 观测方式轴向等条件不变, 调节雾化气流速为0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0 L/min时, 测定1.0 mg/L的磷标准溶液, 光谱发射强度及信噪比随雾化气流速变化如图 5所示。

由图 5可知, 1.0 mg/L的磷标准溶液光谱发射强度随雾化气流速的增大先增强后降低, 在0.8 L/min处达到最高值。这是因为随雾化气流量增加, 单位时间进入等离子体的分析物质增多, 从而使谱线发射强度增大, 但雾化气流量增大到一定程度后, 继续增大其流量, 会使进入等离子体的离子来不及激发而冲出, 分析物被稀释, 同时过大的雾化气流量也会使等离子体温度降低, 缩短元素的停留时间, 最终导致光谱发射强度降低, 信噪比变差。故选择雾化气流速为0.8 L/min。

保持分析谱线P213.617 nm, 射频功率1 300 W, 雾化气流量0.8 L/min, 进样泵速1.5 mL/min, 观测方式轴向等条件不变, 调节观测高度为11、12、13、14、15、16和17 mm时, 测定1.0 mg/L的磷标准溶液, 光谱发射强度及信噪比随观测高度变化如图 6所示。

由图 6可知, 观测高度在11~14 mm, 1.0 mg/L的磷标准溶液光谱发射强度随观测高度的增大而增强, 观测高度在14~17 mm, 1.0 mg/L的磷标准溶液光谱发射强度随观测高度的增大而减弱。合适的观测高度可以提高信噪比, 降低检出限, 综合考虑, 本文选择观测高度为14 mm。

保持分析谱线P213.617 nm, 射频功率1 300 W, 雾化气流量0.8 L/min, 观测高度14 mm, 观测方式轴向等条件不变, 调节蠕动泵泵速为1.0、1.2、1.5、1.8、2.0和2.2 mL/min时, 测定1.0 mg/L的磷标准溶液, 光谱发射强度及信噪比随蠕动泵泵速变化如图 7所示。

由图 7可知, 光谱发射强度随蠕动泵泵速增大而增强, 且在1.0~1.5 mL/min变化较大, 在1.5~2.2 mL/min变化较小, 这可能是因为提高泵速可以提高雾化效率和气溶胶分析物进入等离子体的速率。但泵速过快会使等离子体火焰不稳定, 甚至出现熄火, 也会使样品消耗量增大, 并加速泵管磨损。因此, 本文选择蠕动泵泵速为1.5 mL/min。

众所周知, 采用轴向观测的检出限比径向观测可改善高达10倍。在大量基体存在时, 绝大多数元素的检出限会得到明显改善, 这对分析低含量元素以及谱线发射强度低的元素十分有利。保持分析谱线P213.617 nm, 射频功率1 300 W, 雾化气流量0.8 L/min, 观测高度14 mm, 进样泵速1.5 mL/min等条件不变, 本文对比了轴向和径向两种观测方式下, 1.0 mg/L的磷标准溶液的峰形、强度、信噪比和方法检出限, 结果见表 2。

由表 2可知, 1.0 mg/L的磷标准溶液在两种观测方式下峰形均无干扰, 轴向观测方式下标准溶液和空白的强度均显著大于径向观测方式, 且信噪比高于径向观测, 是径向观测的5.8倍。另外, 轴向观测方法的检出限要小于径向观测, 检出限提高近9倍, 这说明轴向观测的检出能力更强, 更适合磷元素的测定。因此, 本文选择轴向观测方式。

在仪器最优工作条件下, 用标准曲线外标法测定2.2中海洋浮游生物中磷含量, 样品溶液浓度为0.182 mg/L, 换算成质量浓度为80.25 mg/kg。从测定结果可以看出, 用传统的外标法测定海洋浮游生物中磷含量, 由于基体的干扰, 其结果低于标准加入法的测定结果(样品溶液浓度为0.203 mg/L, 换算成质量浓度为89.51 mg/kg), 进一步说明标准加入法可以很好的校正海洋浮游生物样品中严重的基体干扰, 能够提高分析方法的准确性。

为评价方法的准确度和精密度, 对同一份海洋浮游生物样品按1.3.1方法进行处理。称取0.1 g左右的样品两份, 一份加标, 另一份不加标, 消解完全后定容到50 mL。在仪器最佳工作条件, 对样品分别平行测定6次, 每次重复3次读数, 计算回收率和相对标准偏差(RSD)。实验结果显示, 本实验中磷的相对标准偏差RSD为1.36%~1.67%, 加标回收率在92.6%~ 94.3%之间, 说明本方法具有较高的精密度和准确性高, 能够满足海洋浮游生物中磷元素的检测要求。

根据国际纯粹和应用化学联合会(IUPAC)对检出限作出的规定[17], 按3倍标准偏差与斜率的比值计算方法的检出限。本研究以1% HNO3为空白测定12次, 计算标准偏差, 3倍标准偏差与斜率的比值即为方法检出限。本方法中磷的检出限为0.010 mg/L。

为考察所构建方法在实际样品测定中的应用效果, 分别运用ICP-OES法和Grassholf方法[18]对采自渤海湾海域的10个海洋浮游生物样品进行测定, 每个样品进行3个平行样分析, 上机检测取其平均值, 两种方法的测试结果见表 3。由表 3可知, ICP-OES法测定5种浮游植物磷含量的变化范围为1 273~2 242 mg/kg, 5种浮游动物磷含量的变化范围为579.4~740.4 mg/kg。Grassholf法测定5种浮游植物磷含量的变化范围为1 276~2 238 mg/kg, 5种浮游动物磷含量的变化范围为580.5~745.5 mg/kg。结果表明, ICP-OES法与传统Grassholf法的测定结果总体一致, 分析结果准确可靠, 可用于海洋浮游生物样品中磷含量的测定。

本文微波密闭消解预处理样品的基础上, 采用电感耦合等离子体发射光谱法联合标准加入法建立工作曲线, 构建确定了准确测定海洋浮游生物中总磷的技术方法。在测定过程中, 为剔除高盐基体效应及干扰, 以标准加入法取代外标法建立工作曲线, 同时结合样品特异性, 对ICP-OES分析谱线、射频功率、雾化气流速、观测高度、蠕动泵泵速和观测方式等工作条件进行优化, 对海洋浮游生物中总磷进行了准确测定。实验结果显示, ICP-OES最佳工作条件为分析谱线P213.617 nm, 射频功率1 300 W, 雾化气流量0.8 L/min, 观测高度14 mm, 进样泵速1.5 mL/min, 观测方式轴向。标准加入法标准曲线相关系数大于0.999, 相对标准偏差为1.36%~1.67%, 加标回收率为92.6%~94.3%, 方法检出限为0.010 mg/L, 检测结果具有较高的准确度和精密度。该技术方法可为海洋浮游生物及其它高基体生物样品中磷含量的准确测定提供实验参考。